Cynhyrchu a nodweddu biocemegol laccase madarch wystrys NRC 620 a gwerthuso ei effeithlonrwydd wrth egluro sudd afal.

Ar ôl 25 diwrnod o ddeori statig ar 28°C, dangosodd laccase o *Pleurotus ostreatus* NRC620 y gweithgaredd uchaf yn y cyfrwng diwylliant ffwngaidd. Y gwerthoedd pH a thymheredd gorau posibl ar gyfer yr ensym hwn oedd 3.0 a 70°C, yn y drefn honno. Ar ôl 2 awr o ddeori ar 40°C a 50°C, arhosodd gweithgaredd yr ensym yn 68.33% a 59.61%, yn y drefn honno. Ar ôl 2 awr o ddeori mewn byffer sitrad-ffosffad (pH 7.0), arhosodd gweithgaredd yr ensym yn 100%. Cynyddodd ychwanegu 10 mM MgSO₄ a CuSO₄ weithgaredd yr ensym tua 21% a 35%, yn y drefn honno, tra bod NaCl, MnCl₂, KCl, a CaCl₂ wedi atal gweithgaredd yr ensym. Gan ddefnyddio ABTS fel swbstrad, roedd y paramedrau cinetig (Km a Vmax) ar gyfer laccase *Pleurotus ostreatus* NRC 620 yn 1.99 mM a 16,217 μmol min−1 L−1, yn y drefn honno. Gostyngodd triniaeth ensymatig samplau sudd afal y pH a'r gludedd yn sylweddol, ac roedd y gostyngiad hwn yn cydberthyn â chynnydd yn yr amser storio. Arweiniodd triniaeth laccase at ostyngiad bach yng nghyfanswm cynnwys ffenolaidd sudd afal, ond ni welwyd unrhyw ostyngiad mewn gweithgaredd gwrthocsidiol.
Yn ystod y blynyddoedd diwethaf, mae ymchwilwyr wedi canolbwyntio ar gymhwyso biodechnoleg werdd yn y diwydiant bwyd. Mae laccas yn un o'r ensymau mwyaf defnyddiol yn y diwydiant bwyd, gan ddod o hyd i gymwysiadau mewn meysydd fel prosesu sudd, pobi, sefydlogi gwin, a gwella rhinweddau organoleptig cynhyrchion bwyd.¹Mae llawer o blanhigion uwch a micro-organebau yn secretu laccase,²a gall ffyngau fel deuteromycetes, ascomycetes, a basidiomycetes hefyd gynhyrchu laccase.³Mae laccas (EC 1.10.3.2) yn ocsidas glas sy'n lleihau ocsigen moleciwlaidd i ddŵr gan ddefnyddio system sy'n cynnwys tri atom copr gwahanol, a thrwy hynny'n ocsideiddio amrywiol gyfansoddion ffenolaidd ac aminau aromatig. Wrth gynhyrchu sudd ffrwythau a llysiau, mae brownio ensymatig ac anensymatig yn faterion hollbwysig.⁴Gan fod y sylweddau hyn yn effeithio'n negyddol ar liw, blas ac arogl y sudd, rhaid eu tynnu.⁵
O blith yr holl ffrwythau, afalau yw'r rhai a fwyteir fwyaf ledled y byd ac yn yr Undeb Ewropeaidd. Yn 2019, cynhyrchiad afalau oedd y trydydd yn fyd-eang, gan fwy na 87 miliwn tunnell.⁶Mae afalau'n cynnwys nifer o gyfansoddion ffenolaidd, gan gynnwys flavonoidau ac asidau ffenolaidd fel asid caffeig ac asid clorogenig.⁷Gan fod sudd afal fel arfer yn cael ei yfed yn ei ffurf glir, mae tua 50% i 90% o'r cydrannau ffenolaidd yn cael eu colli yn ystod y broses hidlo.⁸Heddiw, mae defnyddwyr yn tueddu i ddewis cynhyrchion sydd wedi'u prosesu i'r lleiafswm, fel sudd afal cymylog gyda chynnwys polyphenol uchel. Fodd bynnag, oherwydd ei gynnwys ffenolaidd uchel, mae'r math hwn o sudd afal yn arbennig o agored i newid lliw a thywyllu.⁹Defnyddir amrywiol dechnolegau, gan gynnwys dulliau trin gwres fel pasteureiddio ar 60–90°C, i leihau neu atal tywyllu sudd afal.¹⁰Fodd bynnag, yn ôl ymchwil gan Sauceda-Gálvez¹¹, gall prosesu thermol ddinistrio cemegau anweddol ac effeithio ar rinweddau organoleptig sudd afal. Mae dewisiadau amgen i ddulliau prosesu thermol yn cynnwys carbon deuocsid uwchgritigol, ymbelydredd uwchfioled, uwchsain, pwysedd hydrostatig uchel, neu homogeneiddio pwysedd uchel.¹²Mae effeithlonrwydd y technolegau hyn a chynnyrch sudd ffrwythau addas yn dibynnu ar y paramedrau a ddefnyddir a nodweddion y cynnyrch. Mae eu defnydd eang yn gyfyngedig gan gostau uchel, effeithiau andwyol ar ansawdd rhai cynhyrchion bwyd, neu anactifadu ensymau annigonol.^13,14
Gellir defnyddio laccase i sefydlogi ac eglurhau sudd ffrwythau.¹⁵Gökmen ac eraill.¹⁶yn argymell defnyddio laccase ar gyfer egluro sudd ffrwythau oherwydd ei fod yn tynnu cyfansoddion ffenolaidd yn effeithiol trwy eu trosi'n bolymerau neu oligomerau sy'n hawdd eu tynnu gan unrhyw bilen uwch-hidlo, gan ganiatáu i sudd afal gynnal lliw ac eglurder sefydlog am hyd at chwe wythnos ar 50°C. Cafodd laccase *Trichoderma* wedi'i buro ei osod yn sefydlog ar gleiniau alwmina a'i ddefnyddio i dynnu cyfansoddion blas drwg a achosir gan halogiad microbaidd sudd afal yn ddetholus.¹⁷
Mae tua 80-90% o gydrannau anweddol sudd afal yn esterau ac aldehydau, sy'n rhoi arogl unigryw i'r sudd.¹⁸Cafodd laccase o *Trametes versicolor* ei osod ar gefnogaeth rhad wedi'i gwneud o ffibr naturiol o gregyn cnau coco ifanc i egluro sudd afal.¹⁹Mae astudiaethau blaenorol wedi ymchwilio i sefydlogi sudd afal (lliw a thyrfedd) gan ddefnyddio dulliau di-ensymau neu ddulliau immobileiddio, neu ar y cyd ag uwch-hidlo.^5,19Fodd bynnag, mae effaith lacasau ffwngaidd ar briodweddau ffisegemegol sudd afal yn ystod storio yn parhau i fod yn aneglur. Felly, nod yr astudiaeth hon oedd ymchwilio'n arbrofol i'r newidiadau yn y priodweddau ffisegemegol, cynnwys cyfansoddion ffenolaidd, a gweithgaredd gwrthocsidiol sudd afal ar ôl triniaeth â lacasau ffwngaidd a storio yn yr oergell am bythefnos. Mae gan lacasau'r gallu i ocsideiddio cyfansoddion ffenolaidd, sy'n eu gwneud yn addawol i'w defnyddio mewn amrywiol brosesau diwydiannol, gan gynnwys egluro sudd. Archwiliodd yr astudiaeth hon lacasau o *Pleurotus ostreatus* NRC 620, gan ganolbwyntio ar yr amodau delfrydol ar gyfer eu gweithgaredd a'u heffeithiolrwydd wrth egluro sudd. Er bod ymchwil ar fadarch wystrys (P. ostreatus NRC 620) yn dal yn gyfyngedig, mae astudiaethau blaenorol wedi archwilio ensymau o amrywiol ffynonellau ffwngaidd, fel Trametes versicolor a Ganoderma lucidum. Nod yr astudiaeth hon oedd gwerthuso cymhwysiad posibl yr ensym hwn yn y diwydiant bwyd a thynnu sylw at ei briodweddau unigryw, yn enwedig ei pH a'i dymheredd delfrydol.
Prynwyd 2,2′-Azooxybis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) gan Sigma-Aldrich (Canada). Roedd yr holl adweithyddion eraill o radd dadansoddol.
Cafodd Canolfan Casglu Diwylliant Microbaidd y Ganolfan Ymchwil Genedlaethol y straen hysbys o fadarch wystrys NRC620. Ar ôl is-ddiwyllio, storiwyd y straen hwn ar slantiau agar dextros tatws ar 4°C. Dyma'r dull paratoi'r inocwlwm: brechwyd myceliwm 10 diwrnod oed, wedi'i ddatblygu'n llawn, ar blatiau agar dextros tatws a'i ddeori ar 28°C. Ar ôl 10 diwrnod, tynnwyd tri bloc myceliwm 12-mm mewn diamedr o'r cyfrwng agar gan ddefnyddio dyrnod metel di-haint a'u rhoi mewn fflasgiau Erlenmeyer 250-mL gyda phlygiau cotwm yn cynnwys 50 mL o gyfrwng diwylliant wedi'i sterileiddio (pH 5.0, fel y disgrifiwyd yn flaenorol gan Othman et al.²⁰). Cafodd y diwylliannau eu magu ar 28°C am 18 diwrnod. Yna cafodd y diwylliannau eu hidlo trwy bapur hidlo Whatman Rhif 1, a gwasanaethodd yr uwchnofiant canlyniadol fel ffynhonnell yr ensym.
Penderfynwyd gweithgaredd laccase gan ddefnyddio ABTS fel swbstrad. Roedd y cymysgedd adwaith (2 mL) yn cynnwys 500 μL o 0.3 mM ABTS (wedi'i doddi mewn byffer sodiwm sitrad 0.1 M, pH 4.5) a'r swm gofynnol o sampl ensym wedi'i wanhau â dŵr distyll.^21,22O ystyried y gall laccase ocsideiddio ABTS ar dymheredd ystafell (28 °C ± 2), penderfynwyd ar ocsideiddio ABTS drwy fesur y cynnydd mewn amsugnedd ar 420 nm (ε₄₂₀= 36,000 cm^-1 M ^-1) gan ddefnyddio sbectroffotomedr UV Agilent Carry-100. Roedd angen un uned o weithgaredd laccase i ocsideiddio 1 μmol ABTS y funud. Penderfynwyd crynodiad protein gan ddefnyddio dull Bradford gan ddefnyddio albwmin serwm buchol fel rheolaeth fewnol.^23,24
Ar ôl cael yr ensym o'r straen madarch wystrys NRC 620, mesurwyd ei weithgaredd ar wahanol gyfnodau tyfu am 25 diwrnod o dan amodau statig ar 28 °C.
I astudio effaith tymheredd ar weithgaredd laccase, cynhaliwyd arbrofion yn yr ystod tymheredd o 20 i 90 °C. Cyn ychwanegu'r ensym a dechrau'r adwaith, cymysgwyd y byffer (0.1 M sodiwm sitrad, pH 4.5) a'r swbstrad (ABTS) a'u magu am 5 munud ar wahanol dymheredd. Aseswyd sefydlogrwydd thermol yr ensym trwy ei magu mewn byffer sodiwm ffosffad 0.05 M (pH 7.0) ar 40, 50, 60, a 70 °C am 2 awr, yn y drefn honno. Yna aseswyd y gweithgaredd gweddilliol gan ddefnyddio'r swbstrad ABTS.
Aseswyd effaith pH ar weithgaredd laccase gan ddefnyddio ABTS fel swbstrad mewn byfferau sitrad-ffosffad 0.1 M gydag ystod pH o 2.5 i 7.0. Deorwyd y toddiant ensym ar 40°C am ddwy awr mewn byfferau sitrad a Tris 0.1 M (pH 3, 4, 6, a 7) i asesu sefydlogrwydd pH. Cyfrifwyd gweithgaredd gweddilliol gydag ABTS fel swbstrad ar ôl deori.
Cafodd y laccas ei ddeori am 10 munud mewn byffer sodiwm ffosffad (0.05 M, pH 7.0) yn cynnwys amrywiol ïonau metel (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+, a Mn2+) ar grynodiadau o 2.5 mM a 10 mM, yn y drefn honno. Yna ychwanegwyd y swbstrad (ABTS) i gychwyn yr adwaith, ac aseswyd y gweithgaredd cymharol.
Mesurwyd ocsidiad ABTS gan laccase ar wahanol grynodiadau (0.025–3 mM) ar pH 4.5 i bennu'r paramedrau cinetig (Vmax a Km). Y^cysonionCyfrifwyd y cysyniadau o hafaliad Michaelis-Menten gan ddefnyddio plot Lineweaver-Burk, sy'n plotio gwrthdro cyfradd yr adwaith fel ffwythiant o grynodiad y swbstrad. Cyfrifwyd y cysonion cinetig o'r plot Lineweaver-Burk gan ddefnyddio meddalwedd GraphPad Prism fersiwn 6.01.
Ar ôl golchi'r afalau'n drylwyr gyda dŵr tap, cawsant eu torri'n eu hanner a'u suddio gan ddefnyddio suddwr afal Braun MP80 cwbl awtomatig (wedi'i wneud yn yr Almaen). Hidlwyd y sudd trwy bedair haen o frethyn caws. Ni ychwanegwyd unrhyw ensymau at y grŵp rheoli, tra ychwanegwyd 2.0% laccase (y crynodiad mwyaf effeithiol a brofwyd) at sudd afal newydd ei baratoi, a gafodd ei storio wedyn ar 4°C am bythefnos.
Penderfynwyd asidedd titradadwy (TA) a pH yn ôl dull Boulton et.^al.27Mesurwyd pH pob sampl gan ddefnyddio mesurydd pH digidol (mesurydd pH JENWAY 3510). Cyfrifwyd asidedd titraadwy (TA) yn seiliedig ar asid malic gan ddefnyddio'r fformiwla ganlynol.
Lle mae V a C yn gyfaint (mL) a chrynodiad (0.1 mol/L) y toddiant sodiwm hydrocsid a ddefnyddir yn y titradiad, yn y drefn honno. K yw'r cyfernod trosi asid malic, sy'n hafal i 0.067, ac W yw màs (g) sudd afal.
Cyfanswm y solidau hydawdd (^TDSPenderfynwyd cynnwys ) yr holl samplau sudd gan ddefnyddio refractomedr poced PAL-1 (ATAGO, Tokyo, Japan). Ar ôl pob mesuriad, rinsiwyd y lens optegol â dŵr wedi'i ddad-ïoneiddio, a phrofwyd pob sampl sudd afal dair gwaith. Cyfrifwyd y gwerth ar gyfer pob sampl trwy gyfartaleddu'r tri mesuriad. Cyfrifwyd y cymedr ± gwyriad safonol ar gyfer pob sampl sudd afal hefyd trwy gyfartaleddu'r canlyniadau hyn.
Aseswyd gludedd y samplau sudd afal gan ddefnyddio fiscomedr cylchdro (RV, Rheotest 2, yr Almaen). Gosodwyd y sampl y tu mewn i silindr “S2″ y fiscomedr. Cynrychiolwyd gludedd ymddangosiadol gan lethr y gromlin straen cneifio yn erbyn cyfradd cneifio, a gyfrifwyd o’r straen cneifio a’r cromliniau cyfatebol ar wahanol gyfraddau cneifio (o 1.00 i 437.4 s⁻¹). Dyma’r fformiwla ar gyfer cyfrifo gludedd ymddangosiadol:
Lle mae η yn cynrychioli'r gludedd ymddangosiadol (cP), τ yw'r straen cneifio (dyn/cm²), γ yw'r gyfradd cneifio (sec⁻¹), a chyfrifir (τ) gan ddefnyddio'r gwerthoedd trorym (α) a silindr (Z) gan ddefnyddio'r fformiwla ganlynol: τ = Z . α.
Penderfynwyd y mynegai brownio yn ôl dull Meidav ​​​​etc.^al.29Cafodd sampl sudd 10-ml ei allgyrchu ar 2750 xg am 10 munud. Cymysgwyd 5 ml o uwchnofaint y sudd â 5 ml o ethanol 95%. Mesurwyd amsugnedd y cymysgedd ar 420 nm gan ddefnyddio sbectroffotomedr UV Shimadzu (UV-1601 PC).
Penderfynwyd cyfanswm y cynnwys ffenolaidd (TPC) yn colorimetrig gan ddefnyddio'r adweithydd Folin-Ciocalteu fel y disgrifiwyd gan Boulton et al.^[27]. Lluniwyd cromlin safonol o asid galig ar gyfer crynodiadau o 0 i 500 mg/L (^r²= 0.997). Mynegir canlyniadau fel cywerthau asid galig (mg GAE/mL).
Ychwanegwch 125 μL o ddŵr distyll a 2850 μL o doddiant FRAP at 25 μL o sudd afal a gadewch y cymysgedd yn y tywyllwch am³⁰mun. Yna mesurwch yr amsugnedd ar 593 nm gan ddefnyddio sbectroffotomedr UV Shimadzu (UV-1601 PC). Paratowyd yr adweithydd FRAP trwy gymysgu byffer asetad 300 mM (pH 3.6), clorid haearn (III) 20 mM, a 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)triasin (TPTZ) (wedi'i doddi mewn 40 mM HCl) mewn cymhareb o 10:1:1. Cynhyrchwyd cromlin safonol gan ddefnyddio Trolox fel y safon (^R²= 0.999), a mynegir y canlyniadau fel μM Trolox/mL.
Penderfynwyd ar weithgaredd gwrthocsidiol y sudd wedi'u trin a'r sudd heb eu trin gan ddefnyddio'r dull DPPH i werthuso eu gallu i sgwrio radicalau rhydd DPPH.³¹Cymysgwyd deg microlitr o sudd ag 1 ml o doddiant DPPH (100 μM) mewn methanol. Ar ôl adweithio yn y tywyllwch am 30 munud, mesurwyd amsugnedd y cymysgedd ar 517 nm gan ddefnyddio sbectroffotomedr UV Shimadzu (UV-1601 PC). Mynegwyd y canlyniadau fel cywerthau trolox (μM trolox/ml) yn seiliedig ar gromlin calibradu (_^R2= 0.990).
Dangosodd y data a gafwyd fod y cynhyrchiad laccase uchaf wedi'i arsylwi mewn madarch wystrys NRC 620 erbyn diwedd y 18fed diwrnod o eplesu, gan gyrraedd gweithgaredd o 1302 U/L. Gwasanaethodd hyn fel sail ar gyfer pennu'r amser tyfu gorau posibl ar gyfer cynhyrchu laccase (Ffigur 1). Er bod cynhyrchiad ensymau wedi cynyddu wrth i'r amser tyfu gynyddu, nid oedd y gyfradd gynnydd yn gymesur yn uniongyrchol â'r amser tyfu; ar ôl 21 diwrnod, dim ond 90 U/L (i 1390 U/L) yr oedd gweithgaredd ensymau wedi cynyddu. Felly, dewiswyd 18 diwrnod yn y pen draw fel yr amser tyfu gorau posibl i gydbwyso cynnyrch y cynnyrch â manteision economaidd cynyddu'r amser tyfu.
Effaith amser tyfu ar gynnyrch laccase yn Pleurotus ostreatus NRC 620. Cafodd tri bloc myceliwm ffwngaidd (12 mm) eu brechu i mewn i 50 ml o gyfrwng di-haint ac yna eu tyfu ar 28 °C am wahanol amseroedd.
Yn gyson ag astudiaethau eraill, mae ein canlyniadau'n dangos bod y cyfnod meithrin delfrydol i gyflawni secretiad laccase brig gan ffwng yn debygol o fod rhwng 7 a 36 diwrnod.³²Yn ôl Ezike ac eraill.³³, Cynhyrchodd *Trametes polyzona* WRF03 y swm uchaf o laccase erbyn diwedd y nawfed diwrnod o eplesu, gyda gweithgaredd penodol o 1637 U/mg o brotein. Ar ben hynny, Othman et al.³⁴canfuwyd bod *Trichoderma harzianum* S7113 wedi secretu llawer iawn o laccase ar y pumed diwrnod o ddiwylliant. Cyrhaeddodd cyfradd cynhyrchu laccase uchafbwynt gweithgaredd ar y pedwerydd diwrnod ar ddeg ac yna gostyngodd yn raddol.³⁴Er y gall secretiad ensymau ddigwydd yn ystod y prif gyfnod twf hefyd, fel arfer mae'n cyrraedd ei anterth yn ystod y cyfnod canolradd ac yn cael ei sbarduno gan ddefnydd o ffynhonnell carbon neu nitrogen.^34,35
Er bod laccase o Pleurotus ostreatus NRC 620 wedi arddangos gweithgaredd uchel dros ystod tymheredd eang o 50°C i 80°C, gan agosáu at ei weithgaredd brig (69–98%), gwelwyd ei weithgaredd uchaf ar 70°C (Ffig. 2a). Y tu allan i'r ystod tymheredd hon, gostyngodd gweithgaredd yr ensym tua 70°C. Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu bod yr ensym yn weithredol ar dymheredd uchel, yn ôl pob tebyg oherwydd bod tymheredd uchel yn cynyddu egni cinetig yr adwaith.
Effaith tymheredd adwaith (a) a pH (b) ar weithgaredd laccase yn *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Cyflawnwyd tymereddau rhwng 20 a 90 °C trwy rag-ddeori'r cymysgedd ar dymheredd gwahanol am 5 munud cyn ychwanegu'r ensym a dechrau'r adwaith. Aseswyd effaith pH ar weithgaredd laccase gan ddefnyddio ABTS fel swbstrad mewn toddiannau sy'n cynnwys byffer sitrad-ffosffad 0.1 M dros ystod pH o 2.5 i 7.0.
Yn ôl Ezike ac eraill^al.33, y tymheredd gorau posibl ar gyfer laccase *Trametes polyzona* WRF03 yw 55 °C, sydd yr un fath â'r tymheredd ar gyfer *Ganoderma lucidum*^laccase36ac yn debyg i'r tymheredd gorau posibl (50 °C) ar gyfer *Trametes polyzona* KU-RNW02737^laccase . ^Baldrian38yn nodi, fel ar gyfer systemau ensymau eraill sy'n diraddio lignin, mai'r ystod tymheredd delfrydol ar gyfer laccase yw rhwng 50 a 70 °C.
Dangosodd y canlyniadau fod yr ensym wedi arddangos y gweithgaredd uchaf ar pH 3.0, gan gyrraedd gweithgaredd o 94% ar pH 3.5. Fodd bynnag, arhosodd yn weithredol dros ystod pH eang o 2.5 i 7.0 (Ffigur 2b). Ar ben hynny, dangosodd weithgaredd uwch mewn amodau asidig o'i gymharu ag amodau niwtral neu alcalïaidd. Arhosodd ei weithgaredd o leiaf 77% dros yr ystod pH o 2.5 i 4.5, ond dim ond tua 38% a gyrhaeddodd ar pH 7.0. Y pH gorau posibl ar gyfer laccase o *Trametes polyzona* WRF03 oedd 4.533, sydd yr un fath â'r pH ar gyfer laccases o *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40, a *Trametes hirsuta* 41. Fodd bynnag, yn ôl yr astudiaeth gan Chairin et al.⁴², y pH gorau posibl ar gyfer laccase o *Polymorpha f. sp.* WR710-1 yw 2.2, tra bod y pH gorau posibl ar gyfer laccase o *Polymorpha f. sp.* IBL-04 yn 5.043. Gall rhwymo anionau hydrocsid (atalydd laccase) i atomau copr laccase T2/T3 fod yn rheswm dros y gweithgaredd laccase is o dan amodau pH niwtral neu alcalïaidd. Gall hyn amharu ar y trosglwyddiad electronau mewnol o'r ganolfan T1 i'r ganolfan T2/T3, a thrwy hynny^cyfyngugweithgaredd yr ensym23,44
Drwy ddeori'r ensym ar dymheredd gwahanol, canfuwyd bod amser deori a thymheredd yn effeithio ar sefydlogrwydd yr ensym. Yn arbennig, dangosodd laccase o *Trametes polyzona* NRC 620 sefydlogrwydd uwch ar 40℃ a 50℃, gan gadw 68.33% a 59.61% o'i weithgaredd cychwynnol, yn y drefn honno, ar ôl 120 munud (Ffigur 3a). Mewn cyferbyniad, o dan yr un amodau (40℃ a 50℃, 120 munud), cadwodd laccase o *Trametes polyzona* WRF03 64.38% a 42.92% o'i weithgaredd, yn y drefn honno.³³I'r gwrthwyneb, gostyngodd cynyddu amser magu a thymheredd sefydlogrwydd laccase *Trametes polyzona* NRC 620; Ar ôl magu ar 60℃ a 70℃ am 60 munud, gostyngodd ei weithgaredd i 39.24% ac 1.72%, yn y drefn honno (Ffigur 3a). Yn gyson â'r canlyniadau arbrofol, dangosodd laccase o *Trametes polyzona* WRF03 sefydlogrwydd uwch ar 40 a 50℃ drwy gydol y broses driniaeth thermol.³³Yn yr un modd, Lueangjaroenkit ac eraill^al.37a Chairin et^al.42adroddodd am sefydlogrwydd laccases o Trametes polyzona KURNW027 a Trametes polyzona WR710-1 ar 50 °C am 1 awr, yn y drefn honno. Fel biocatalydd defnyddiol y gellir ei gymhwyso mewn amrywiol feysydd biotechnolegol, dylai laccase fod â sefydlogrwydd a pherfformiad da dros ystod tymheredd eang.
Sefydlogrwydd thermostatig (a) a sefydlogrwydd pH (b) laccase o *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Aseswyd sefydlogrwydd thermostatig trwy ddeori'r toddiant ensym mewn byffer sodiwm ffosffad 0.05 M (pH 7.0) ar 40, 50, 60, a 70 °C am 2 awr, yn y drefn honno. Aseswyd sefydlogrwydd pH trwy ddeori'r toddiant ensym mewn byffer sitrad 0.1 M a byffer Tris (pH 3, 4, 6, a 7) ar 40 °C am 2 awr. Cyfrifwyd gweithgaredd gweddilliol gan ddefnyddio ABTS fel swbstrad ar ôl deori.
Er mwyn pennu'r amodau gorau posibl ar gyfer defnyddio a storio ensymau, fe wnaethom ymchwilio i effaith pH ar sefydlogrwydd laccase. Effeithiodd dod i gysylltiad â gwahanol werthoedd pH yn sylweddol ar sefydlogrwydd strwythur y protein, a thrwy hynny ddylanwadu ar sefydlogrwydd a gweithgaredd moleciwl yr ensym. Dangosodd y canlyniadau fod yr ensym yn llai sefydlog o dan amodau asidig, tra ei fod yn dangos gwell sefydlogrwydd ar werthoedd pH uwch (rhanbarthau niwtral ac alcalïaidd). Ar werthoedd pH o 7.0, 6.0, 4.0, a 3.0, roedd cyfraddau cadw ensymau ar ôl 120 munud tua 100%, 62.54%, 52.39%, ac 11.14%, yn y drefn honno (Ffig. 3b). Dangosodd laccase *Strombus multisus* WRF03 sefydlogrwydd uwch ar werthoedd pH niwtral (5.5–6.5) a sefydlogrwydd is ar werthoedd pH asidig (islaw 4.0). Ar ôl 120 munud ar werthoedd pH o 5.5, 6.0, a 6.5, roedd cyfraddau cadw ensymau tua 82%, 100%, a 93%, yn y drefn honno.³³Khairin ac eraill.⁴²nododd fod laccase o Trametes polyzona WR710-1 yn sefydlog yn yr ystod pH o 6.0 i 7.0, tra bod Sayed et al.⁴⁵dangosodd fod laccase yn fwy sefydlog o dan amodau pH niwtral. Fodd bynnag, dangosodd laccase o Cerrena unicolor sefydlogrwydd hefyd o dan amodau alcalïaidd (pH 9.0)⁴⁶Dangosodd y lacasau a astudiwyd sefydlogrwydd uchel dros ystod pH eang. Gall hyn fod yn nodwedd bwysig ar gyfer cymwysiadau diwydiannol.
Gan fod gan rai ïonau metel effeithiau ysgogol ac ataliol ar weithgaredd ensymau, rhaid ystyried eu heffeithiau ar weithgaredd ensymau mewn cymwysiadau diwydiannol. Mae hyn yn hanfodol oherwydd bod ïonau metel yn halogion amgylcheddol cyffredin a all effeithio ar sefydlogrwydd a synthesis ensymau allgellog.⁴⁷Er mwyn ymchwilio i effeithiau ïonau metel lluosog ar laccase o *Pleurotus ostreatus* NRC 620, cynhaliwyd arbrofion cyfatebol. Fel y dangosir yn Ffigur 4, yn dibynnu ar y math o fetel a ddefnyddir, roedd cynyddu crynodiad yr ïon metel o 2.5 mM i 10 mM yn effeithio'n negyddol ar swyddogaeth yr ensym. Er enghraifft,^Mg²⁺ , ^Co²⁺ , ^Zn²⁺, a^Cu²⁺gallai ysgogi ac actifadu gweithgaredd yr ensym, tra^Na⁺ , ^Mn²⁺ , ^Ca²⁺, a^K⁺gallai atal gweithgaredd yr ensym. Ar grynodiad o 10 mM, ïonau Cu²⁺ a Mg²⁺ oedd yr actifadyddion mwyaf grymus o weithgaredd laccase o *Pleurotus ostreatus* NRC 620, gan ddarparu gradd actifadu o tua 34% a 20%, yn y drefn honno. Fodd bynnag, ar grynodiad o 10 mM, ïonau Ca²⁺ oedd yr atalydd mwyaf grymus o laccase, gan leihau gweithgaredd yr ensym tua 60%.
Effaith ïonau metel ar weithgaredd laccase Pleurotus ostreatus NRC 620. Cafodd y laccase ei ddeori am 10 munud mewn byffer sodiwm ffosffad (0.05 M, pH 7.0) yn cynnwys amrywiol ïonau metel ar grynodiadau o 2.5 mM a 10 mM. Yna cychwynnwyd yr adwaith trwy ychwanegu'r swbstrad (ABTS), ac ar ôl hynny mesurwyd y gweithgaredd cymharol.
Mae ein canlyniadau yn gyson â chanlyniadau awduron eraill a ganfu fod Mg²⁺ a Cu²⁺ yn gwella gweithgaredd *Trametes polyzona* WRF03³. Canfu Castaño et al.⁴⁸ fod lacase o *Xylaria* sp. yn cael ei ysgogi i ryw raddau gan ïonau copr (Cu²⁺). Ar ben hynny, cynhaliodd Foroutanfar et al.⁴⁹ a Si et al.⁵⁰ astudiaethau tebyg ar lacase o *Paraconiothyrium variabile* a *Trametes pubescens*, yn y drefn honno. Gall safle rhwymo copr math II (T2) yr ensym hwn gael ei ddirlawn â Cu²⁺ ar grynodiad penodol, a all esbonio ysgogiad gweithgaredd lacase ar grynodiadau Cu²⁺³⁹ uwch. Gan fod laccases ffwng pydredd gwyn yn ocsidasau sy'n cynnwys atomau copr lluosog, mae effeithiau ïonau copr ar weithgaredd laccase yn amrywiol ac yn amrywio o ysgogol ac ataliol i niwtral.⁵¹ Mewn cyferbyniad, Zhou et al^[52]adroddodd fod^Cu²⁺ataliodd weithgaredd laccase termit tanddaearol Taiwan (Odontotermes formosanus). Fodd bynnag, laccaseau Cerena sp. HYB07^[53]a Clitocybe maxima^[54]ni chawsant eu heffeithio gan ïonau copr.
Cynrychiolwyd penodolrwydd y swbstrad gan ei baramedrau cinetig (Km a Vmax); po gryfaf oedd affinedd rhwymo'r swbstrad i'r ensym, yr isaf oedd gwerth Km a'r uchaf oedd penodolrwydd y swbstrad.^3,21,55Penderfynwyd ar y paramedrau cinetig (Km a Vmax) o laccase o *Pleurotus ostreatus* NRC 620 gan ddefnyddio meddalwedd GraphPad Prism 6.0 drwy blotio'r plot Lineweaver-Burk (Ffigur 5). Wrth ddefnyddio ABTS fel swbstrad, y canlyniadau oedd 1.99 mM a 16217 μmol.^{min⁻¹ L⁻¹,}yn y drefn honno. Elsayed et al.²¹adroddwyd bod y gwerthoedd Km ar gyfer ocsideiddio ABTS yn 0.1 mM a 0.064 mM, yn y drefn honno, sy'n dangos affinedd uchel isoensymau Lac A a Lac B ar gyfer ABTS. Ar ben hynny, roedd y gwerthoedd Vmax yn 0.182 μmol^min⁻¹a 0.603 μmol^min⁻¹, yn y drefn honno. Roedd y gwerth Km a gafwyd yn is na gwerth Trametes polyzona WRF03 (8.66 mM); ar ben hynny, roedd eu gwerth Vmax (1429 mmol min⁻¹) hefyd yn^isafwrth ddefnyddio ABTS fel swbstrad.33 Yn yr un modd, roedd gwerthoedd Km crynodiadau laccase Lentinus squarrosulus MR13 a Trametes sp. AH28-2 yn 0.0714 mM a 0.025 mM, yn y drefn honno, a'r gwerthoedd Vmax oedd 0.0091 mM min−1 a 0.67 mM min−1 mg−1 (o'i gymharu ag ABTS)^{, yn y drefn honno.56,57}
Ymchwiliwyd i effaith crynodiad ABTS ar weithgaredd laccase o *Pleurotus ostreatus* NRC 620, a phlotiwyd plot Lineweaver-Burk o'r gwrthgyferbyniad o gyflymder yr adwaith cychwynnol yn erbyn crynodiad ABTS. Mesurwyd adwaith ocsideiddio ABTS gyda chrynodiadau gwahanol (0.025–3.0 mM) o laccase ar pH 4.5 i bennu'r paramedrau cinetig (Vmax a Km). Cyfrifwyd y cysonion cinetig Michaelis-Menten gan ddefnyddio'r plot Lineweaver-Burk o'r gwrthgyferbyniad o gyflymder yr adwaith yn erbyn crynodiad y swbstrad. Cyfrifwyd y cysonion cinetig o'r plot Lineweaver-Burk gan ddefnyddio meddalwedd GraphPad Prism 6.01.
Mae ensymau eglurhau traddodiadol, fel pectinasau, yn hydrolysu sylweddau pectig, gan leihau gludedd a chymylogrwydd. Maent yn chwalu polysacaridau strwythurol yn effeithiol ac yn aml yn cael eu defnyddio ar y cyd ag ensymau eraill, fel cellwlasau a hemicellulasau, i wella cynnyrch ac eglurder. Fodd bynnag, nid yw pectinasau yn targedu cyfansoddion ffenolaidd yn benodol, sef y prif gyfranwyr at gymylogrwydd a brownio ocsideiddiol, yn enwedig mewn sudd fel sudd afal a grawnwin.⁵⁸Mewn cyferbyniad, mae laccases yn cataleiddio ocsideiddio cyfansoddion ffenolaidd, gan eu polymeru'n foleciwlau mwy, anhydawdd y gellir eu tynnu trwy waddodi neu hidlo. Mae'r mecanwaith hwn nid yn unig yn gwella eglurder ond mae hefyd yn ymestyn oes silff sudd trwy leihau'r tebygolrwydd o frownio ocsideiddiol a achosir gan gyfansoddion ffenolaidd. Ar ben hynny, gellir cynnal prosesau eglurhau sy'n seiliedig ar laccase o dan amodau prosesu ysgafn (pH 3.5–5.5, tymheredd 25–40 °C), gan eu gwneud yn addas ar gyfer sudd cain heb beryglu eu priodweddau maethol neu organoleptig.⁵⁹Mae astudiaethau wedi dangos y gall triniaeth pectinase egluro sudd mewn 1–2 awr, tra bod triniaeth laccase fel arfer yn gofyn am amser adwaith hirach (3–6 awr) i leihau cyfansoddion ffenolaidd yn llwyr. Fodd bynnag, gellir optimeiddio'r broses hon trwy atal yr ensym rhag symud neu drwy gyfuno laccase â dulliau eglurhau mecanyddol.⁶⁰Yn yr astudiaeth hon, datgelodd proffilio ensymau'r dyfyniad crai weithgareddau sylweddol o ran laccase ac α-amylas, tra bod gweithgareddau pectinase a xylanase yn isel iawn, ac ni chanfuwyd gweithgaredd cellwlase. Felly, roedd y gostyngiad mewn tyrfedd a chynnwys ffenolaidd yn bennaf oherwydd gweithred laccase, tra gallai'r newid mewn gludedd fod yn rhannol oherwydd gweithred amylas.
Mae Tabl 1 yn dangos y paramedrau ffisegemegol ar gyfer sudd afal wedi'i wasgu'n ffres a samplau wedi'u trin â laccase. Dangosodd y canlyniadau fod cynnyrch sudd afal wedi'i wasgu'n ffres (71.59%) yn is na chynnyrch samplau wedi'u trin â laccase (87.34%). Mae'r canlyniadau hyn yn gyson â chanfyddiadau Pilnik ac Orange.⁶¹, a nododd y gall defnyddio ensymau wrth brosesu ffrwythau gynyddu cynnyrch sudd, gwella hidlo, a chael sudd clir o ansawdd uchel ar gyfer crynodiad. Mae'r cynnydd yng nghynnyrch sudd yn bennaf oherwydd y cynnydd yng nghynnwys siwgrau hydawdd yn y sudd. Yn ystod hydrolysis ensymatig ffrwythau, mae mesoglea a phectin ym muriau celloedd y cynnyrch yn cael eu dinistrio a'u trosi'n sylweddau hydawdd fel siwgrau niwtral ac asidau.^62.Roedd gwerth pH y sudd afal a gafodd ei drin ag ensymau yn sylweddol is na gwerth pH y grŵp rheoli (P < 0.05), a chynyddodd gwerth pH y ddau grŵp yn sylweddol yn ystod y storio (Tabl 1). Mae'r canlyniadau hyn yn gyson â rhai Mark et al.⁶³, a nododd fod pH sudd ffrwythau cnau cashew wedi gostwng ar ôl ei storio ar ôl triniaeth wres. Gall diraddio pectin a ffurfio asid galacturonig ar ôl triniaeth ensymau fod yn gyfrifol am y cynnydd mewn pH yn ystod y storio. Arhosodd pH samplau a gafodd eu trin ag ensymau rhwng 4.05 a 4.31 drwy gydol y storfa, tra bod pH sudd afal heb ei drin yn amrywio rhwng 4.12 a 4.33.
Dangosodd cyfanswm asidedd (TA) samplau heb eu trin a samplau wedi'u trin â laccase duedd ostyngol wrth i amser storio gynyddu (Tabl 1). Priodolwyd y gostyngiad mewn asidedd i drosi asidau organig yn garbohydradau neu adweithiau ensymatig, yn ogystal ag ocsideiddio yn ystod storio sudd.⁶⁴Roedd cyfanswm asidedd y samplau sudd afal rheoli a'r samplau a gafodd eu trin ag ensymau yn is nag asidedd suddoedd eraill (sudd mefus 0.9%, sudd eirin 2.2%, sudd cwmcwat 1.0%, sudd bricyll 2.4%, sudd oren 0.8%), ond yn debyg i asidedd suddoedd eraill (e.e., sudd gellyg 0.3%).⁶²Gall y gwahaniaethau hyn mewn sudd afal ffres wedi'i wasgu heb ei drin fod oherwydd amrywiol ffactorau megis amodau tyfu, ffactorau genetig, lefel aeddfedrwydd, a dulliau prosesu.⁶⁵Mae'r gostyngiad yn asidedd cyfanswm y sudd afal rheoli a'r sudd afal wedi'i drin â laccase yn gyson â'r canlyniadau a gyflwynwyd gan Singh et al.⁶⁶ynghylch y gostyngiad yng nghyfanswm asidedd sudd afal Jin Nuo ar ôl 74 diwrnod o storio. Ar y llaw arall, Oshmiansky a Wojdylo⁶⁷ni chanfuwyd unrhyw newidiadau sylweddol yn asidedd sudd afal wrth astudio effaith dulliau eglurhau traddodiadol.
Mae'r canlyniadau a gyflwynir yn Nhabl 1 yn dangos bod gwerth cyfanswm y solidau hydawdd (TSS) yn y sudd afal a gafodd ei drin â laccase yn uwch na gwerth y sampl heb ei drin. Mae'r canlyniadau hyn yn gyson â'r astudiaethau cyhoeddedig.^{. 68}Ar ben hynny, mae Tabl 1 yn dangos bod gwerth TSS y grŵp sudd afal rheoli yn 9.58 ar yr amser cychwynnol ac wedi cyrraedd 11.05 erbyn diwedd y cyfnod storio. Mae'r gwerthoedd hyn yn is na gwerthoedd TSS sudd afal ffres a adroddwyd gan Hamid et al.^{. 69}(11.2 ac 11.80, yn y drefn honno). Cynyddodd gwerth TSS y samplau sudd afal a gafodd eu trin â laccase yn sylweddol, gan ddechrau o 11.23 a chyrraedd 12.93 ar ôl pythefnos o storio ar 4°C (Tabl 1). Gwelwyd cynnydd tebyg yn TSS yn ystod storio hefyd mewn ffrwythau sitrws, lemwn ac orennau melys. Gall y cynnydd mewn cyfanswm solidau hydawdd (TSS) yn ystod storio fod oherwydd hydrolysis polysacaridau (startsh) i monosacaridau (siwgrau), y cynnydd mewn crynodiad oherwydd dadhydradiad sudd, a diraddio pectin yn y sudd i solidau hydawdd. Mae'n debyg bod y cynnydd mewn cyfanswm solidau hydawdd (TSS) oherwydd y cynnydd mewn siwgrau hydawdd, a all gael eu ffurfio trwy drosi pectin neu gellwlos yn siwgrau hydawdd gan pectin neu gellwlas, yn y drefn honno, neu trwy hydrolysis startsh i siwgrau, fel yr adroddwyd gan Hamed et al.^69.Gellir gweld effaith laccase ar briodweddau sudd afal yn weledol, gan fod sudd afal wedi'i drin â laccase yn dangos llif gwell a gludedd is na sudd heb ei drin. Cofnodir yr arsylwad hwn yn Nhabl 1; Roedd gludedd y sampl a gafodd ei drin ag ensymau yn 1.87 cP, tra bod gludedd y sampl rheoli yn 2.95 cP. Mae'n debyg bod y gostyngiad sylweddol hwn mewn gludedd oherwydd y gallu dal dŵr uwch sydd gan sylweddau tebyg i bectin a ffurfio strwythur rhwydwaith cydlynol.
Yn yr astudiaeth hon, ymchwiliwyd i effaith laccase ar fynegai brownio (BI) sudd afal trwy fesur yr amsugnedd ar 420 nm gan ddefnyddio sbectroffotomedr. Dangosir y canlyniadau yn Nhabl 1. Yn ystod y storio, dangosodd BI samplau sudd afal yn y grwpiau a gafodd eu trin a'r rhai heb eu trin duedd raddol o gynyddu. Mae BI yn adlewyrchu graddfa'r brownio a gall wasanaethu fel^pwysigdangosydd o adweithiau brownio ensymatig ac an-ensymatig. Cynyddodd yr amsugnedd yn sylweddol yn ystod y storio (P < 0.05). Ar ddiwedd y storio, y_A420Cynyddodd gwerth samplau sudd afal yn y grwpiau rheoli a'r grwpiau a gafodd driniaeth ensymau tua 217% a 121%, yn y drefn honno (Tabl 1). Mae'r canlyniadau'n dangos y gall triniaeth ensymau leihau'r radd brownio yn effeithiol tua 56%. Canlyniadau Bezerra et al.^[19] yn gyson â'n canlyniadau ni; Defnyddion nhw ffibr laccase-glutaraldehyde-cnau coco i egluro sudd afal, gan leihau ei liw gwreiddiol 61%.
Er bod gan polyffenolau mewn sudd ffrwythau effeithiau maethol a therapiwtig cadarnhaol ar y corff dynol, gallant hefyd adweithio â phroteinau, gan achosi cymylogrwydd, gwaddodiad, neu dyrfedd yn y sudd, a thrwy hynny newid blas ac arogl y cynnyrch a lleihau ei oes silff.⁷¹Nod yr astudiaeth hon oedd lleihau cynnwys cyfansoddion ffenolaidd sudd afal yn ddiogel gan ddefnyddio laccase o Pleurotus ostreatus NRC 620. Mae'r canlyniadau a gyflwynir yn Nhabl 1 yn dangos bod cyfanswm cynnwys cyfansoddion ffenolaidd sudd afal wedi'i drin â laccase wedi'i leihau'n sylweddol cyn ei storio ar 4 °C. Ar ben hynny, gostyngodd cyfanswm cynnwys cyfansoddion ffenolaidd hefyd yn ystod y storio yn y ddau sampl a astudiwyd (Tabl 1). Ymchwil gan Sandri et al.⁷²dangosodd y gall sudd afal wedi'i drin ag ensymau gadw ei weithgaredd gwrthocsidiol a'i gynnwys cyfansoddion ffenolaidd. Fodd bynnag, mae canlyniadau astudiaeth gan Lettera et al.⁷³yn dangos y gall trin sudd oren â lacase ffwngaidd leihau cynnwys cyfansoddion ffenolaidd ynddo hyd at 45%.
Dangoswyd bod gan gyfansoddion ffenolaidd briodweddau fel sborion radical rhydd, lleihau a diffodd ocsigen sengl, trosglwyddo atom hydrogen, a rhoi electronau i radicalau rhydd, gan eu gwneud yn gwrthocsidyddion cryf.⁷⁴Felly, yn yr astudiaeth hon, defnyddiwyd dulliau seiliedig ar DPPH a FRAP i werthuso effaith laccase ar weithgaredd gwrthocsidiol sudd afal a storiwyd mewn oergell am 14 diwrnod (Tabl 2). Dangosodd y ddau ddull gynnydd mewn gweithgaredd gwrthocsidiol yn ystod storio, a allai fod oherwydd y cynnydd mewn cyfansoddion ffenolaidd rhydd neu ffurfio cynhyrchion adwaith Maillard (MRPs), gyda chynhyrchion adwaith Maillard yn debygol o fod yn achos y cynnydd mewn gweithgaredd gwrthocsidiol.⁷⁵Mae adweithiau brownio anensymatig (gan gynnwys diraddio asid asgorbig, adweithiau Maillard, a diraddio siwgrau wedi'i gatalyddu gan asid) yn cynhyrchu pigmentau brown (melanoidinau). Gall cynhyrchion diraddio asid asgorbig canolradd a chynhyrchion diraddio siwgr (megis cyfansoddion carbonyl) adweithio ag asidau amino trwy adweithiau Maillard.⁷⁶Er bod brownio ffrwythau a llysiau yn ystod storio wedi'i astudio'n helaeth, mae ein dealltwriaeth o'r adweithiau hyn yn parhau i fod yn gyfyngedig.⁷⁷O'i gymharu â'r dull FRAP, dangosodd sudd afal wedi'i drin â laccase weithgaredd gwrthocsidiol sylweddol is gan y dull DPPH (Tabl 2), a chynyddodd gweithgaredd gwrthocsidiol yr holl samplau yn sylweddol wrth i'r amser storio gynyddu. Defnyddiwyd dau ddull gwahanol ar gyfer pennu gweithgaredd gwrthocsidiol yn yr astudiaeth hon oherwydd bod eu hegwyddorion yn wahanol. Mae'r dull DPPH yn mesur y gallu i niwtraleiddio radicalau rhydd, tra bod y dull FRAP yn mesur y gallu i leihau ïonau haearn. Felly, argymhellir defnyddio dulliau lluosog ar gyfer pennu gweithgaredd gwrthocsidiol er mwyn deall gweithgaredd gwrthocsidiol y samplau a astudiwyd yn well.⁷⁸
Un o ganfyddiadau allweddol yr astudiaeth hon yw bod laccase *Pleurotus ostreatus* NRC 620 yn arddangos gweithgaredd gorau posibl ar 70°C a pH 3.0. O'i gymharu â laccase ffwngaidd eraill a ddefnyddir yn gyffredin ar gyfer egluro sudd, fel laccase *Trametes versicolor* a *Ganoderma lucidum*, mae *P. ostreatus* NRC 620 yn arddangos sefydlogrwydd thermol uwch a pH mwy asidig. Mae laccase o *Trametes versicolor* a *Ganoderma lucidum* fel arfer yn arddangos gweithgaredd gorau posibl yn yr ystod o 50-60°C ac ar werthoedd pH rhwng 3.5 a 5.0. Gall y gwahaniaeth hwn gyfrannu at effeithlonrwydd egluro sudd gwell, yn enwedig ar gyfer sudd asidig lle mae sefydlogrwydd ar werthoedd pH is yn hanfodol. Nodwedd unigryw *P. O'i gymharu â laccase ffwngaidd eraill a astudiwyd, mae *Pleurotus ostreatus* NRC 620 yn arddangos y gallu i weithredu'n effeithiol o dan amodau mwy heriol. Mae ei dymheredd gweithgaredd gorau posibl uwch yn awgrymu manteision posibl mewn cymwysiadau diwydiannol, megis cyfraddau adwaith cyflymach a halogiad microbaidd is. Gall ei pH isel, sy'n addas iawn i natur asidig llawer o sudd, fod yn ddefnyddiol mewn prosesau egluro sudd. Mae'r canlyniadau hyn yn cyfiawnhau archwiliad pellach ar gyfer cymhwysiad ar raddfa fawr, gan wneud *Pleurotus ostreatus* NRC 620 yn ddewis arall hyfyw i ffynonellau laccase ffwngaidd traddodiadol. O'i gymharu ag astudiaethau blaenorol, gwelsom mai'r tymheredd gorau posibl yw 60°C a'r pH gorau posibl yw 3.0. Ar ôl adwaith ar 60°C am 80 munud, cadwyd laccase *Ganoderma lucidum*⁴⁶% o'i weithgarwch.79 Yn ôl Kurniawati a Nicelle⁸⁰Mae ensymau *Ganoderma lucidum* yn arddangos sefydlogrwydd rhagorol i gymedrol ar 25°C a gwerthoedd pH yn amrywio o 5.0 i 8.0, a sefydlogrwydd ar pH 6.0 a thymheredd yn amrywio o 10 i 30°C. Yn yr astudiaeth hon, gwelsom mai'r pH a'r tymheredd gorau posibl ar gyfer gweithgaredd ensymau ar gyfer *Pleurotus ostreatus* oedd 3.0 a 70°C, yn y drefn honno. Ar ôl magu ar 40°C a 50°C am ddwy awr, cadwodd yr ensym 68.33% a 59.61% o'i weithgaredd, yn y drefn honno. Ar ben hynny, dangosodd laccase Pleurotus ostreatus NRC 620 weithgaredd uchel dros ystod tymheredd eang o 50°C i 80°C, gan bron â chyrraedd y gweithgaredd mwyaf (69%–98%), gyda'r gweithgaredd mwyaf yn cael ei arsylwi ar 70°C.
I gloi, dangosodd laccase madarch wystrys NRC620, a gafwyd o dan amodau statig, weithgaredd a sefydlogrwydd gorau posibl ar draws ystod o amodau pH a thymheredd, gan ddangos sefydlogrwydd uwch o'i gymharu â ffynonellau ensymau eraill. Cynyddodd ychwanegu 10 mM MgSO₄ a CuSO₄ weithgaredd ensymau tua 21% a 35%, yn y drefn honno. Pan gafodd ei brosesu'n sudd afal, gostyngodd yr ensym y pH a'r gludedd, tra mai dim ond ychydig bach y gostyngodd y cynnwys ffenolaidd yn ystod y storio.
Mae'r canlyniadau'n cadarnhau potensial laccase yn y diwydiant bwyd, yn enwedig mewn eglurhad diodydd. Drwy chwalu cyfansoddion ffenolaidd yn benodol, nid yn unig y mae laccase yn lleihau tyrfedd ac yn gwella eglurder ond mae hefyd yn cynnal ansawdd sudd ffrwythau o dan amodau gweithredu ysgafn. Yn wahanol i asiantau eglurhad traddodiadol fel gelatin, bentonit, a silica gel, nid yw laccase yn cynhyrchu gwastraff nac yn tynnu arogleuon dymunol o ddiodydd, gan ei wneud yn opsiwn mwy ecogyfeillgar a chynaliadwy. Ar ben hynny, o'i gymharu ag ensymau a dulliau hidlo eraill, mae laccase yn cynnig ateb wedi'i dargedu a chost-effeithiol heb beryglu ansawdd y cynnyrch.
Kyomuhimbo, HD a Brink, HG. Cymwysiadau a strategaethau immobileiddio lacâses sy'n cynnwys copr; adolygiad. Heliyon 9, e13156 (2023).